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合理补充丁酸的工程酵母菌助力IBD的细胞治疗

A tailored series of engineered yeasts for the cell-dependent treatment of inflammatory bowel disease by rational butyrate supplementation

Gut Microbes

PMID: 38381494 [IF: 12.2]

炎症性肠病 (IBD) 的治疗主要包括药物干预、生活方式调整，严重者需要外科治疗，实现长期的临床缓解是IBD预后管理的重要目标。研究表明，IBD患者与健康人相比，肠道的丁酸水平显著降低。丁酸是一种短链脂肪酸，具有抗炎特性，有利于恢复肠上皮屏障稳态、调节免疫、维持肠道微生态平衡，对IBD具有潜在的治疗效果。靶向调节肠道中的丁酸含量，有望从细胞途径实现IBD的精准治疗。

目前使用丁酸缓解结肠炎症的方法包括口服丁酸盐、补充丁酸盐产生菌、丁酸盐微胶囊以及针对特定部位给药的靶向治疗，但均存在一定局限性。口服丁酸的生物利用度有限，大多数丁酸产生菌不能直接利用膳食纤维，需要与其他细菌交叉给药，且安全性有待验证；而丁酸微胶囊和靶向技术的成本较高。

酿酒酵母作为益生菌合成的天然产物，在食品和医药领域有着广泛的应用。使用酿酒酵母合成丁酸可作为IBD的潜在治疗方法。该研究开发了一种新型的丁酸盐给药技术，改造酿酒酵母使其生产丁酸盐。通过评价不同外源丁酸合成基因对酵母丁酸合成的贡献，构建4个关键基因的异源表达，开发出可合成丁酸的重组酿酒酵母菌株，同时在工程酵母菌株中加入了额外的代谢模块，增加丁酸的产量。在IBD患者和动物模型中评估后，研究确定了一株BYJ16菌株，具备最佳的丁酸合成能力和治疗效果。

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图1. 治疗IBD的丁酸产生菌的构建流程。(a) IBD患者肠腔内丁酸含量低于正常人。(b) 以酿酒酵母为基础，重构丁酸合成途径，通过调节代谢模块，构建一系列具有不同丁酸生产能力的工程酵母。(c) 丁酸盐工程酵母J16可使IBD患者肠道内丁酸水平恢复到正常水平；丁酸释放可调节肠道微生物组的动态平衡。(d) 丁酸盐工程酵母J16可使结肠炎小鼠肠道中的丁酸恢复到正常水平。

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图源：参考文献 [1]

结果

① 酿酒酵母丁酸生物合成途径的构建

丁酸的生物合成涉及几个酶促反应：乙酰乙酰-辅酶A通过3-羟丁基-辅酶A脱氢酶的作用转化为3-羟基丁酰辅酶A，随后在环氧乙酰-辅酶A水合酶的作用下转化为巴豆酰辅酶A。巴豆酰辅酶A经过还原生成丁酰辅酶A，最后转化为丁酸。研究选择了编码3-羟丁基-辅酶A脱氢酶和环氧乙酰-辅酶A水合酶的C. beijerinckii Hbd和Crt基因，用于改造酵母菌合成丁酸。

普氏杆菌是主要的丁酸产生菌，约占所有粪便微生物的5%，是肠道中最丰富的细菌。为使丁酰辅酶A和乙酰辅酶A转移酶异源表达，催化丁酰辅酶A转化为丁酸，人工合成了普氏杆菌中编码这两种酶的BCoAT基因，并对酵母密码子偏好进行了优化。进一步评估发现，酿酒酵母中的Hbd、Crt、Ter和BCoAT基因的表达有利于丁酸盐的产生。研究先将普氏杆菌的丁酸合成系统整合到酿酒酵母中，未能将乙酰乙酰-辅酶A转化为丁酸。随后，将基因的启动子调控元件组装成表达框，并整合到BY4741菌株的基因组构建了重组菌株BYJ01，其丁酸产量为420 mg/L。

② 结合代谢模块提高丁酸酯产量

根据丁酸合成的代谢通路，研究者在BYJ01菌株中同时过表达与乙酰乙酰辅酶A代谢相关的ERG10和MCT1基因，得到重组菌株BYJ04，发现BYJ04菌株的丁酸产量高于BYJ01 (702 mg/L vs 420 mg/L)。乙酰辅酶A是合成乙酰乙酰辅酶A的关键前体，涉及苹果酸合成酶的代谢途径可能导致乙酰辅酶A的消耗，导致丁酸产量的减少。通过敲除编码苹果酸合成酶的MLS1基因构建菌株BYJ05，其丁酸产量增加到792 mg/L。为了进一步提高乙酰辅酶A水平，敲除BYJ05菌株的CIT2基因获得重组菌株BYJ06，丁酸产量升高至943 mg/L。随后，在BYJ06中过表达与乙酰辅酶A合成相关的ACS1和ACS2基因，或只表达ACS1基因，构建菌株BYJ08和BYJ07，二者丁酸产量分别升高至1.24 g/L和1.06 g/L。

既往研究表明，乙醇脱氢酶基因ADH1和ADH4的敲除可以有效地提高酿酒酵母2，3-丁二醇的产量。因此，研究评估了菌株BYJ08敲除ADH4或同时敲除ADH1和ADH4对丁酸酯产量的影响，构建菌株BYJ12和BYJ13。BYJ12 (敲除ADH4) 的丁酸盐产量降至0.8 g/L，而ADH4和ADH1同时敲除的BYJ13丁酸产量增加至1.3 g/L。由于NADH在乙醛还原为乙醇的过程中被消耗，敲除ADH基因导致还原途径中断，可导致NADH释放，增加丁酸产量。为了释放更多NADH，研究者同时敲除了BYJ08菌株的GPD1和GPD2基因，干扰甘油合成，获得了双基因敲除菌株BYJ15，丁酸产量显著提高。进一步敲除BYJ08中的ADH1和ADH4，GPD1和GPD2，获得了重组菌株BYJ16，其丁酸酯产量达到1.45 g/L。

③ 工程酵母在复杂氧分压环境中的性能

鉴于肠道中氧气分布的不规则性，研究评估了工程酵母在不同氧分压下的表现。在测试菌株中，BYJ17在厌氧条件下丁酸产量最高，为2.47g/L，而在富氧条件下为1.84g/L。其他工程酵母菌如BYJ07、BYJ12和BYJ16，在厌氧条件下的丁酸产量也比富氧条件下增加。因此，工程酵母更适合在厌氧环境中生产丁酸。研究同时证实，乙酰辅酶A增强模块增强了工程酵母厌氧条件下的丁酸合成，且工程酵母即使在在低氧条件下，也能保持最佳的丁酸产量。

④ 工程酵母菌调节IBD患者的肠道微生物组

为评估丁酸工程酵母对结肠炎的疗效，研究者采集了6名轻中度溃疡性结肠炎患者的粪便样本评估肠道微生物，6名健康志愿者作为对照。将样本在厌氧条件下培养，通过在工程酵母中添加不同的代谢模块 (J1到J17)，培养物中的丁酸含量随丁酸合成增强而增加，其中J17的丁酸产量最高。同时发现，IBD组肠道微生物的多样性显著减少，而利用工程酵母干预可逆转这一变化，表明工程酵母通过产生丁酸，可改善IBD患者肠道微生物的组成。

丁酸工程酵母菌 (J8、J16和J17) 通过产生丁酸盐、增加乳酸杆菌和双歧杆菌等益生菌的相对丰度以及减少有害细菌的存在，调节IBD患者肠道微生物群的动态平衡。然而由于丁酸产量的不同，工程酵母的治疗效果也不相同。其中，J16分泌适量的丁酸盐，对轻至中度UC患者的肠道微生物组具有最显著的改善效果，即最大限度地增加益生菌的相对丰度，有效调节肠道微生物组的动态平衡 (图2)。

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图2. 丁酸工程酵母菌调节IBD患者肠道微生物群的动态平衡。(a) 使用工程酵母在体外干预IBD患者肠道微生物区系的技术路线图。(b) 不同工程酵母对IBD患者肠道微生物组干预24小时后培养物中丁酸含量的变化。(c) 观察不同工程酵母菌处理后肠道微生物组的物种丰富度。(d和e) 用CHO-1估计量和α指数分析肠道微生物群的多样性。(f) β-多样性分析。(g) 主坐标分析。

图源：参考文献 [1]

⑤ 工程酵母对TNBS诱导的IBD小鼠的治疗作用

研究进一步评估了工程酵母在TNBS诱导的C57BL/6小鼠结肠炎中的治疗效果。将小鼠分为6组：对照组、模型组 (TNBS)、BY组 (TNBS+BY)、J8组 (TNBS+J8)、J16组 (TNBS+J16) 和J17组 (TNBS+J17)。除对照组和模型组外，其余各组小鼠每天口服不同的工程酵母菌 (BY、J8、J16和J17) 直到第7天。测定小鼠结肠内容物中的丁酸水平，以评估工程酵母将丁酸分泌到肠道中的能力。通过监测体重、疾病活动指数 (DAI)、结肠长度、结肠组织学评分和脾重量的变化，评估工程酵母的治疗效果。

结果显示，BY处理组小鼠的丁酸含量最低，J17治疗组肠道中丁酸含量最高，且高于对照组，可能对小鼠结肠炎的治疗效果不利。而通过J16补充丁酸盐，比J17丁酸盐产量略低，可使结肠炎小鼠的丁酸含量恢复到正常水平，可作为结肠炎的最佳治疗剂量。

与TNBS组相比，TNBS+J8、TNBS+J16和TNBS+J17组小鼠的体重增加，疾病活动指数(DAI) 降低，结肠长度增加，脾重量减少，组织学严重程度得到改善，但急性结肠炎的严重程度并未明显改善 (图3)。此外，工程酵母显著降低了促炎细胞因子水平，增加抗炎细胞因子水平。J16表现出最显著的抗炎作用，其炎症因子如IL-6的水平较低，而抗炎因子如IL-10的水平较高，而J17的抗炎作用不如J16显著。

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图3. 工程酵母对TNBS诱导的小鼠结肠炎模型的治疗作用。(a) TNBS诱导的结肠炎和工程酵母 (BY、J8、J16和J17) 给药的实验方案。(b) 各组小鼠结肠腔内丁酸含量。(c-e) 每日体重，(d)每日DAI评分和(e)小鼠经直肠灌肠后的结肠长度。(f) 各组小鼠的结肠组织图像。(g) H&E染色。(h) 每组小鼠的结肠损伤评分。

图源：参考文献 [1]

综上，该研究利用合成生物学方法实现了酿酒酵母菌株丁酸的合成，并通过调节工程酵母的丁酸产量，以达到体内外治疗IBD的最佳效果。研究证实了补充丁酸对IBD的治疗作用，通过恢复丁酸水平恢复肠道菌群稳态，有望为IBD的精准治疗提供新的参考。

致谢

中南大学湘雅三医院 王思丹 傅甜

浙江大学医学院 孙誉郝

浙江大学 陈杰

对本篇文章解读做出的贡献

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